pic
ОНКОТЕРМИЯ – новое качество лечения онкозаболеваний

+7 (499) 504-41-32
info@oncothermia.ru

Онкотермия.Ру

Онкотермия.Ру − специализированный интернет-сайт, посвященный проблемам онкотермии, качественно нового комплементарного метода лечения онкологических заболеваний.

Внедрение онкотермии в практику онкологии в качестве базового метода, наряду с хирургией, лучевой и химиотерапией, приведет к качественному изменению лечения: 10-20%-ному увеличению выживаемости и значительному повышению качества жизни пациентов.

Онкотермия − новое качество лечения онкологических заболеваний.


"Модулированная электрогипертермия" на Википедии.


+7 (499) 50-44-132
info@oncothermia.ru

OT.ru_qrcode

  РИА РБК
Rambler's Top100
Главная / Онкотермия / ИССЛЕДОВАНИЯ / Доклинические исследования / Нетермозависимые механизмы, качественная оценка in vivo и in vitro

Исследования

« Назад

Нетермозависимые механизмы, качественная оценка in vivo и in vitro  04.07.2010

     

    Предварительный эксперимент

    Первоначально, факт отсроченного эффекта однократного онкотермического воздействия нуждался в достоверном подтверждении. С этой целью было исследовано 30 голых мышей с парными опухолями ксенотрансплантата линии HT29, как это подробно описано в предыдущем исследовании.

    Дизайн исследования

    mice

    Было исследовано по 3 особи на каждое время забоя с момента окончания сеанса электро-гипертермии: 0 ч (сразу после окончания), 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 ч.

    Результаты

    Ниже представлен частный результат эксперимента для всего временного периода.

    mouse0.jpg  mouse0.5.jpg mouse1.jpg  mouse2.jpg  mouse4.jpg 
    Контроль control_0.5.jpg control_1.jpg control_2.jpg control_4.jpg
    Онкотермия OT_0.jpg OT_0.5.jpg OT_1.jpg OT_2.jpg OT_4.jpg
    mouse8.jpg  mouse12.jpg  mouse24.jpg  mouse48.jpg  mouse72.jpg 
    Контроль control_8.jpg control_12.jpg control_24.jpg control_48.jpg control_72.jpg
    Онкотермия OT_8.jpg OT_12.jpg OT_24.jpg OT_48.jpg OT_72.jpg

    На макропрепаратах отчетливо видно, как клеточное повреждение прогредиентно нарастает после воздействия онкотермии в опытных опухолях, оставаясь на исходном уровне  в контрольных.

    Частичные результаты для интервалов 0.5, 8, 24 и 72 ч представлены ниже.

    МАКРОПРЕПАРАТ

    0.5 ч 8 ч 24 ч 72 ч
    контроль control_8_macro.jpg control_24_macro.jpg control_72_macro.jpg

    мЭГТ
    (онкотермия)

    mEHT_0.5_macro.jpg mEHT_8_macro.jpg mEHT_24_macro.jpg mEHT_72_macro.jpg

    МИКРОПРЕПАРАТ х10

    0.5 ч 8 ч 24 ч 72 ч
    контроль control_0.5_10x.jpg control_8_10x.jpg control_24_10x.jpg control_72_10x.jpg
    мЭГТ
    (онкотермия)
    mEHT_0.5_10x.jpg mEHT_8_10x.jpg mEHT_24_10x.jpg mEHT_72_10x.jpg

    МИКРОПРЕПАРАТ х100

    0.5 ч 8 ч 24 ч 72 ч
    контроль control_0.5_100x.jpg control_8_100x.jpg control_24_100x.jpg control_72_100x.jpg 
    мЭГТ
    (онкотермия)
    mEHT_0.5_100x.jpg mEHT_8_100x.jpg mEHT_24_100x.jpg mEHT_72_100x.jpg

    Выводы:

    • Клеточное повреждение в результате однократного онкотермического воздействия развивается постепенно, в течение 72 часов.
    • Онкотермическое воздействие является пусковым фактором процесса, приводящего к отсроченной гибели клеток.
    • Предположительно эффект реализуется путем стимуляции апоптоза.

    Исследование динамики апоптоза

    Методика:

    Исследование динамики апоптоза выполнялось на иммуногистохимическом микроанализаторе тканей TMA Master System (3D Histech) при помощи набора Click-It® TUNEL Alexa Fluor® 488  (Invitrogen).

    TMA Master System

    Контроль Онкотермия
    х20
    х40

    Исследование апоптоза через 24 часа после воздействия онкотермии. Большая часть клеток опухоли находится в состоянии апоптоза.

    Гипертермия (42°С) Онкотермия (42°С)
    Окраска DAPI
    Окраска TUNEL-FITC

    Иммногистохимическое исследование при помощи набора для определения гибели клеток (In Situ Cell Death Detection Kit, Rosche). DAPI (диамидино-2-фенилиндол) окрашивает только двойные спирали ДНК (неповрежденные). Напротив, TUNEL-FITC энзиматически помечает разрывы цепи ДНК (поврежденные). При онкотермии доля поврежденных спиралей ДНК значительно меньше, чем при гипертермии, а доля неповрежденных значительно выше.

    Выводы:

    Гибель клеток при онкотермическом воздействии обусловлена преимущественно апоптозом, а при гипертермии - преимущественно некрозом.

    Исследование динамики межклеточных контактов

    Исходя из рабочей гипотезы, что процессы апоптоза в значительной части опосредуются непосредственной межклеточной коммуникацией, и известный факт нарушения межклеточных соединений при злокачественной транформации является важным фактором нарушения естественных путей передачи апоптического сигнала, а также  из предполагаемой способности экстрацеллюлярного онкотермического электрического поля восстанавливать межклеточные соединения в злокачественых тканях посредством пространственной ориентации белковых молекул или иными путями, было предпринято исследование динамики межклеточных контактов после онкотермического воздействия.

    Основную роль в передаче межклеточных сигналов играют щелевые контакты и сцепные соединения. Первые можно контролировать по содержанию коннексина, являющегося структурным белком щелевых контактов, а вторые - по содержанию кадгеринов и бета-катенина, основных структурных белков сцепных соединений.

    Исследование динамики щелевых контактов

    Коннексин 4 ч 24 ч 72 ч
    Нелеченный
    контроль
    Онкотермия

    Выводы: вследствие онкотермического воздействия значительно возрастает содержание коннексина, что свидетельствует об увеличении числа щелевых контактов.

    Исследование динамики сцепных соединений

    Исследование динамики сцепных соединений в культуре А431 in vitro

    Объект: смешанная культура плоскоклеточной эпителиальной карциномы человека А431 и нормальных фибробластов кожи человека (100,000 кл/мл).

    Воздействие: онкотермическое или гипертермическое воздействие (42°С) в течение часа, затем инкубация при 37°С в течение 24 часов.

     

    Группы:

     

    • нелеченный контроль
    • гипертермия 42°С
    • онкотермия 42°С
    Регистрация: фиксация, окрашивание анти-бета-катенином (Novocastra) и набором для связанных полимеров (Leica); конфокальная микроскопия (Nikon-BioRad).

    Результаты: Значительное и достоверное повышение содержания е-кадгерина и β-катенина после онкотермического воздействия; в контроле без изменений; после гипертермического воздействия изменение содержания е-кадгерина и β-катенина недостоверно в сравнении с нелеченным контролем.

    Нелеченный
    контроль
    Гипертермия
    42°С
    Онкотермия
    42°С
    Е-кадгерин
    β-катенин

    Выводы: онкотермическое воздействие приводит к восстановлению сцепных соединений в культуре A431 in vitro;  этот эффект носит нетермический характер.

    Исследование динамики сцепных соединений в культуре HepG2 in vitro 

    Объект: изолированная монокультура гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2.

    Дизайн эксперимента поностью повторяет описанный выше, с тем отличием, что образцы отбирались через 1, 3  и 24 часа, а окраска выполнялась мышиным  анти-бета-катенином (Zymed).

    Результаты: Значительное и достоверное повышение содержания β-катенина после онкотермического воздействия; в контроле без изменений; после гипертермического воздействия изменение содержания β-катенина недостоверно в сравнении с нелеченным контролем.

    1 ч 3 ч 24 ч
    Нелеченный
    контроль
    Гипертермия
    42°С
    Онкотермия
    42°С

    Выводы: онкотермическое воздействие приводит к восстановлению сцепных соединений в культуре HepG2 in vitro;  этот эффект носит нетермический характер.

    Исследование динамики сцепных соединений на модели карциномы HT29 in vivo 

     

    Дизайн эксперимента повторяет предыдущее исследование.

    Объект: ксенотрансплантат клеток человеческой колоректальной карциномы HT29, билатеральные опухоли на голых мышах.

    Воздействие: онкотермическое воздействие (42°С) в течение 30 минут затем инкубация при 37°С в течение 24 часов. Контроль по нелеченным контрлатеральным опухолям.

    Забой: через 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 часа.

    Регистрация: фиксация, окрашивание гемалан-эозином; иммуногистохимическое окрашивание анти-бета-катенином; микроскопия.

    Результаты: Значительное и достоверное повышение содержания β-катенина после онкотермического воздействия in vivo; в контроле без изменений;.

    Макропрепарат
    (гемалан-эозин)
    0.5 ч
    8 ч
    24 ч

    72 ч

    Нелеченный
    контроль
    b-catenin_control_0.5_macro.jpg b-catenin_control_8_macro.jpg b-catenin_control_24_macro.jpg b-catenin_control_72_macro.jpg
    Онкотермия
    42°С
    b-catenin_OT_0.5_macro.jpg b-catenin_OT_8_macro.jpg b-catenin_OT_24_macro.jpg b-catenin_OT_72_macro.jpg

    Макропрепарат
    (IHCH)

    Нелеченный
    контроль
    b-catenin_control_0.5_x1.jpg  b-catenin_control_8_x1.jpg b-catenin_control_24_x1.jpg b-catenin_control_72_x1.jpg
    Онкотермия
    42°С
    b-catenin_OT_0.5_x1.jpg b-catenin_OT_8_x1.jpg b-catenin_OT_24_x1.jpg b-catenin_OT_72_x1.jpg
    Микроскопия
    (х50, IHCH)
    Нелеченный
    контроль
    b-catenin_control_0.5_x50.jpg b-catenin_control_8_x50.jpg b-catenin_control_24_x50.jpg b-catenin_control_72_x50.jpg
    Онкотермия
    42°С
    b-catenin_OT_8_x50.jpg b-catenin_OT_0.5_x50.jpg b-catenin_OT_24_x50.jpg b-catenin_OT_72_x50.jpg

    Выводы: онкотермическое воздействие приводит к восстановлению сцепных соединений на модели ксенотрансплантата клеток человеческой колоректальной карциномы HT29 у голых мышей in vivo;  этот эффект носит нетермический характер.

    Исследование динамики экспрессии белка p53

    Белок p53 (клеточный опухолевый антиген p53) является важнейшим фактором противоопухолевой защиты организма.

    Дизайн эксперимента полностью повторяет предыдущий эксперимент.

    Результаты:

    Макропрепарат
    (гемалан-эозин)
    0.5 ч 8 ч
    24 ч

    72 ч

    Нелеченный
    контроль
    b-catenin_control_0.5_macro.jpg b-catenin_control_8_macro.jpg b-catenin_control_24_macro.jpg b-catenin_control_72_macro.jpg
    Онкотермия
    42°С
    b-catenin_OT_0.5_macro.jpg b-catenin_OT_8_macro.jpg b-catenin_OT_24_macro.jpg b-catenin_OT_72_macro.jpg

    Макропрепарат
    (IHCH)

    Нелеченный
    контроль
    p53_control_0.5_x1.jpg  p53_control_8_x1.jpg b-catenin_control_24_x1.jpg b-catenin_control_72_x1.jpg
    Онкотермия
    42°С
    b-catenin_OT_0.5_x1.jpg p53_OT_8_x1.jpg p53_OT_24_x1.jpg p53_OT_72_x1.jpg
    Микроскопия
    (х50, IHCH)
    Нелеченный
    контроль
    p53_control_0.5_x50.jpg p53_control_8_x50.jpg p53_control_24_x50.jpg p53_control_72_x50.jpg
    Онкотермия
    42°С
    p53_OT_0.5_x50.jpg p53_OT_8_x50.jpg  p53_OT_24_x50.jpg p53_OT_72_x50.jpg

    Значительное и достоверное повышение содержания p53 после онкотермического воздействия in vivo наблюдается уже через 0.5 часа, и сохраняется до 72 часов; повышение содержание p53, измеренное по относительной площади маски белка p53 в препарате (красный цвет), после онкотермии составляет более 20% по сравнению с 11% в контроле.

    p53_result.jpg

    Выводы: онкотермическое воздействие приводит к выраженной экспрессии белка p53.

    Исследование динамики экспрессии HSP70

    Исходя из рабочей гипотезы о том, что нарушение фукнции мембран злокачественных клеток при онкотермическом воздействии и экспрессии части внутриклеточных HSP на наружной мембране, что может быть одним из факторов активации апоптоза при онкотермии, было предпринято исследование динамики внеклеточной экспрессии HSP70 после онкотермического воздействия.

    Дизайн эксперимента

    Исследование выполнено на модели ксенотрансплантата линии человеческой эпителиальной карциномы A431 на голых мышах по описанному ранее дизайну.

    Нелеченный
    контроль
    Гипертермия 42°С Онкотермия 42°С

    Результаты: зарегистрировано значительная экспрессия внеклеточного HSP70 после воздействия онкотермии in vivo, что находится в полном соответствии с рабочей гипотезой.

    Выводы:результатом онкотермического воздействия является нарушение целостности мембран злокачественных клеток, что приводит к экспрессии HSP на их наружной мембране, что, возможно, является одним из факторов активации апоптоза при онкотермии.

    Результаты и их обсуждение

    Эксприментально подтверждено, что:
    • клеточное повреждение после однократного онкотермического воздействия in vivo развивается прогредиентно в течение 72 часов;
    • преимущественным механизмом клеточного повреждения при онкотермическом воздействии in vivo является апоптоз;
    • онкотермическое воздействие вызывает:
      • дестабилизацию и повышение проницаемости мембран злокачественных клеток  in vivo (повышенная экспрессия внеклеточного HSP70);
      • восстановление межклеточной коммуникации путем реструктуризации щелевых контактов (коннексины) и сцепных соединений (кадгерины, β-катенины) in vitro и in vivo;
      • повышенную экспрессию белка р53 in vivo, являющегося важным компонентом противоопухолевой защиты.
    • практически все перечисленные механизмы имеют полностью либо преимущественно нетермическую природу.
    В целом, прояснился механизм отсроченной клеточной гибели при онкотермическом воздействии. Онкотермия запускает ряд процессов, вызывающих стимуляцию апоптоза:
    • восстанавливает нарушенную межклеточную коммуникацию и естественные пути передачи сигнала апоптоза;
    • вызывает дестабилизацию мембран и экспрессию внутриклеточных HSP на наружной поверхности мембраны злокачественных клеток, что является "меткой" для запуска апоптоза;
    • вызывает активацию белка р53, который либо останавливает клеточный цикл и репликацию ДНК, либо запускает процесс апоптоза.


    Новости

    11.1721
    Гипертермия - хроники пикирующего бомбардировщика: опубликовано письмо редактору The Lancet Oncology

    TheLancetOncologyОпубликовано письмо "Неоадъювантная химиотерапия без и с регионарной гипертермией при саркомах мягких тканей" редактору журнала The Lancet Oncology.

    11.1706
    ОНКОТЕРМИЧЕСКИЕ ПУБЛИКАЦИИ 2017
    k5c_gj4bВ журнале BMJ Open опубликовано исследование С.В. Русакова "Клинико-экономическая оценка модулированной электрогипертермии в сочетании с высокодозовым темозоломидом в режиме 21/28 дней при лечении рецидивной глиболастомы: ретроспективный анализ двухцентрового немецкого когортного исследования с систематическим сравнением и анализом "эффект-лечение".
    10.1716
    Онкотермия в Саудовской Аравии

    537439Онкотермия получила регистрацию и начинает активное продвижение в Саудовской Аравии.

    Анонсы

    ICHS_Log.gifwfcms235-я ежегодная конференция ICHS совместно с 5-ой ежегодной конференцией Международного Федерации обществ китайской медицины - специального комитета по натуропатии (WFCMS-SCNT) состоится в ноябре 2017 года в Гуанчжоу (Китай).