Исследования

Предпосылки

Многочисленные предыдущие эксприменты по сравнению онкотермии с гипертермией имели один недостаток: онкотермия сравнивалась с "чистой" гипертермией посредством нагрева в водяной бане или близкого к ней ифракрасного нагрева, тогда как на практике все современные методы гипертермии используют электромагнитный, радиочастотный или микроволновой нагрев, имеющий, наряду с собственно гипертермией, также полевой компонент. Поэтому вопрос, как поведет себя онкотермия в сравнении не просто с нагревом, а с электромагнитным нагревом, в особености с емкостным нагревом, прототипом онкотермии, оставался открытым. Иными словами, вопрос заключался в том, основан ли эффект онкотермии исключительно на свойствах излучения высокочастотного диапазона, которые не зависят от типа применяемого устройства, или решающую роль играют заявленные принципиальные отличия онкотермических систем, а именно импедансное сопряжение и фрактальная модуляция.

Выбор метода сравнения

В качестве метода сравнения была выбрана система Thermotron-RF8 (Yamamoto Vinita Co. Ltd., Япония).

Название: Thermotron-RF8
Производитель: Yamamoto Vinita Co. Ltd.
Страна: Япония
Год выхода на рынок: 1985
Назначение: Локальная, глубокая гипертермия
Технология: Электромагнитная ёмкостная гипертермия
Рабочая частота: 8.0 МГц
Мощность: 1800 (2000) Вт
Контроль: инвазивная термометрия

Thermotron-RF8 - это "золотой стандарт", эталон классической температурной гипертермии, пожалуй, единственная гипертермическая установка в мире, в которой последовательно и досконально реализована классическая температурная концепция локальной гипертермии в емкостной технологии исполнения. Технология Thermotron-RF8 в рамках классической гипертермической концепции практически совершенна. Она обеспечивает максимальный нагрев среди всех существующих и когда-либо существовавших гипертермических систем при наибольшей равномерности нагрева и максимально возможной его селективности. Так, Thermotron-RF8 способен нагревать опухоль до 42.5°C, при этом окружающие здоровые ткани нагреваются приблизительно на 1°C меньше. К примеру, другой лидер гипертермического рынка, система BSD2000, не в состоянии нагреть опухоль выше 42°C (обычно 40.5-41.5°C), при этом окружающие ткани нагреваются приблизительно на 0.5°C сильнее, чем опухоль. Кроме того, Thermotron-RF8 и онкотермические системы работают в высокочастотном диапазоне на близких частотах (8.0 МГц и 13.56 МГц), поэтому ссылки онкотермии на присущие ей радиочастотные эффекты в равной степени могут относиться к Термотрону. Более того, частота 8.0 МГц имеет некоторое преимущество перед частотой 13.56 МГц, используемой в онкотермии: у нее существенно больше глубина проникновения (приблизительно 20-24 см против 14-16 см в случае плоской волны), и она находится дальше от верхней границы диапазона бета-дисперсии (около 50 МГц).  

Вопрос исследования

Таким образом, прямое сравнение с Термотроном дает однозначный ответ на вопрос, являются ли заявленные эффекты онкотермии ее уникальной особенностью, основанной на технологических решениях, или же они определяются свойствами самого излучения высокочастотного диапазона, которые не зависят от типа применяемого устройства, и, соответственно, в равной степени присущи всем радиочастотным емкостным системам.

Материалы и методы

Объект

Cуспензия клеток гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 (1 х 10⁶ клеток) в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 ммоль L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma), помещалась в пластиковый пакет.

Контроль культивировался в монослое при 37°C. 

Эксперимент дублировался на следующих клеточных линиях:

• рака молочной железы MCF7;
• рака толстой кишки WiDr;
• опухоли головного мозга U87MG.

Воздействие

• Нагрев до 42°C в течение 15 минут.
• Поддержание постоянной температуры 42°C в течение 30 минут.

Метод:
Модулированная электрогипертермия (МЭГТ)	Емкостная гипертермия (ЕГТ)
Система:
LabEHY (Oncotherm, Германия)	Thermotron-RF8 (Yamamoto Vinita, Япония)
Аппликатор:
LabEHY in vitro applicator	диаметр 70 мм
Частота:
13.56 МГц	8.0 МГц
Мощность:
10-12 Вт	16-19 Вт
Температура:

Контрольный нагрев (обычная гипертермия, ГТ) с теми же температурными характеристиками осуществлялся в водяной бане.

Термометрия:

Оптический термосенсор Luxtron FOT Lab Kit (LumaSense Technologies)
Сенсор 1: пакет с культурой клеток
Сенсор 2: окружающая вода

Исследование апоптоза

Клетки HepG2 (5×10⁵ клеток) после воздействия высевались на 6-луночной плашке, культивировались в течение 24 часов, трипсинизировались и дважды отмывались фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Апоптоз оценивался при помощи Annexin-V Apoptosis Kit (BD Pharmingen): после окраски Аннексином-V и пропидий-йодидом клетки инкубировались 10 мин. в темноте на льду, затем аннексин-позитивные клетки анализировались на проточном цитометре FACSCalibur с п/о Cell Quest Pro (Becton Dickinson). 

Анализ фракционированной ДНК (суб-G1)

После 24-часовой инкубации 1×10⁶ клеток HepG2 трипсинизировались и дважды отмывались PBS. Клеточные сгустки суспендировались в 1 мл 70% этанола в течение 30 мин при –20°C, затем центрифугировались, ресуспендировались в 1 мл красящего раствора пропидий-йодида (0.04 мг/мл пропидий-йодида, 100 мкг/мл безДНКазной РНКазы А), и инкубировались при 37°C в течение 20 мин. с последующей проточной цитометрией.

Анализ каспазоподобной активности

Каспазоподобная активность оценивалась при помощи CaspGLOW™ Fluorescein Active Caspase-3, 8, 9 Staining Kit (BioVision), определяющего анутриклеточные активные каспазы при помощи меченного флюоресцеин изотиоцианатом (FITC) Asp-Glu-Val-Asp-флюорометилкетона (DEVD-FMK), который проникает в клетки и необратимо связывается с активными каспазами-3, 8 и 9. После инкубации, 3×10⁵ клеток инкубировались в течение 1 часа с FITC-DEVD-FMK при 37°C, затем дважды отмывались PBS и флуоресценция регистрировалась на проточном цитометре. 

Анализ активных форм кислорода (ROS)

Уровень ROS изчался при помощи 2′,7′– дифлорофлуоресцин диацетата (DCFDA): 1×10⁶ клеток HepG2 отмывались PBS, ресуспендировались в PBS с 0.25 мкмоль DCFDA и инкубировались в темноте в течение 30 мин при 37°C, после чего анализировались на проточном цитометре.

Анализ внутриклеточных белков (вестерн-блот)

5×10⁵ клеток HepG2 растворялись в радиоиммунопреципитационном буфере (RIPA, Sigma) с таблетками ЭДТА-депривированных коктейлей протеазных и фосфатазных ингибиторов (Roche). В лизате измерялось содержание общего белка при помощи набора с бицинхониновой кислотой (Pierce). Общий белок (20 мкг) подвергался электрофорезу в 10% полиакриламидном геле (ПАГ), перенесенном на Immobilon-P поливинилидендифторидные мембраны (Millipore), и блокировался трис-буферным раствором (TBS)-Tween 20 и 5% обезжиренным молоком в течение 1 ч при комнатной температуре. Фильтры исследовались антителами анти-Hsp70 (Santa Cruz Biotechnology) или анти-GAPDH (Sigma) при 4°C в течение ночи в TBS-0.05% Tween 20 с 5% обезжиренным молоком с последующей 1-часовой инкубацией при комнатной температуре с вторичным антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories)в том же буфере. Блоты определялись хемилюминесцентным детектором (ECL, GE Life Science).

Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки культивировались как описано в предыдущем разделе, высевались на предметные стекла, и немедлено фиксировались 3.7% параформальдегидом в теечние 15 мин. (здесь и далее все при комнатной температуре). Кдетки отмывались PBS, блокировались буфером (PBS + 3% BSA) в течение 30 мин. и пермеабилизировались инкубацией с 0.1% Triton X-100 (Sigma) в PBS в течение 15 мин. Для окраски бета-катенина клетки отмывались PBS, инкубировались 16 ч с козьими антителами против человеческого бета-катенина (R&D systems) при 4°C и окрашивались FITC-конъгированными ослиными антителами против козьего IgG (H&L) (Abcam) в течение 60 мин. Для окраски Е-кадгерина клетки прямо окрашивали Alexa Fluor 488-конъюгированными кроличьими моноклональными антителами против человеческого E-кадгерина (24E10) в течение 16 ч при 4°C с последующим 5-кратным отмыванием в PBS с 0.05% Tween 20. Затем предметные стекла в водном растворе (Fisher Scientific) подвергались конфокальной флуоресцентной микроскопии при помощи микроскопа Olympus FV1000.

Статистическая обработка

Результаты сравнивались посредством непарного t-теста (2-стороннее распределение) или одностороннего дисперсионного анализа. 

Результаты

Индукция апоптоза

Индукция апоптоза оценивалась по количеству аннексин-позитивных клеток и по содержанию фракционированной ДНК (суб-G1).

Доля аннексин-позитивных клеток после МЭГТ (43.1%±5.8%) была значительно и достоверно выше, чем после ЕГТ (10.0%±0.6%), ГТ 42°C (8.4%±1.7%) или в контроле 37°C (6.6%±1.1%), и приблизительно соответствовала доле аннексин-позитивных клеток при ГТ 46°C. Нагрев до 58°C приводил в полному апоптозу (термоабляция).

Подобным образом, увеличение доли клеток с фрагментированной ДНК (суб-G1) после МЭГТ составило 15.67%±1.76% против 4.1%±0.0% после ЕГТ и 3.65%±0.49% после ГТ 42°C. 

Индукция активных форм кислорода (АФК)

МЭГТ вызывала значительную и достоверную индукцию АФК (4.87±0.18), тогда как ЕГТ - незначительную и недостоверную (2.35±0.82) по сравнению с ГТ (1.54±0.06).

Активация каспазо-индуцированной клеточной смерти

МЭГТ вызывала значительную активацию каспаз-3, 8 и 9 через 24 часа после воздействия, в отличие от ЕГТ и ГТ.

Экспрессия кальретикулина

Экспрессия кальретикулина после МЭГТ составила 13.2%±2.65% против 2.03%±0.67% после ЕГТ и 1.57%±0.31% после ГТ.

Внутриклеточная и внеклеточная экспрессия HSP70

Все методы ГТ вызывали одинаковую 5-кратную внутриклеточную экспрессию HSP70 против контроля 37°C. Эта экспрессия была термоспецифической, о чем говорит неизменное содержание  нетермоспецифического белка  глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH).

Через 48 часов после МЭГТ внеклеточная экспрессия HSP70 увеличивалась в 10 раз против контроля 37°C, тогда как при ЕГТ и ГТ - в 3-4 раза, и при ЕГТ достоверно не отличалась от ГТ.

Восстановление межклеточных соединений

Применение МЭГТ сопровождалось ростом экспрессии белков межклеточных соединений - Е-кадгерина и бета-катенина, - в отличие от ЕГТ и ГТ.

Интерпретация результатов

МЭГТ, в отличие от ЕГТ и ГТ:

• индуцирует апоптоз;
• индуцирует каспазо-зависимые пути клеточной смерти;
• индуцирует кальций-зависимые пути клеточной смерти;
• индуцирует внеклеточную экспрессию HSP70;
• индуцирует экспрессию белков межклеточных соединений.

Внеклеточная экспрессия внутриклеточных белков и активация кальций-зависимых механизмов, связанная с притоком внеклеточного и внуриклеточного кальция в цитоплазму, связаны, очевидно, с генерализованным повышением мембранной проницаемости: мембранотропный эффект является основой МЭГТ, в отличие от других методов ГТ. Внеклеточная экспрессия стрессовых внутриклеточных белков является триггером апоптоза. Экспрессия белков межклеточных соединений (возможно, связанная, в числе прочего, с ориентировочным эффектом МЭГТ) приводит к торможению генерализации, контактному торможению деления, восстановлению межклеточной коммуникации и путей передачи сигналов апоптоза. В совокупности, повышение мембранной проницаемости и восстановление межклеточных соединений при МЭГТ приводят в резкой активации апоптоза.

Выводы

• Клеточные эффекты МЭГТ in vitro принципиально отличаются от ЕГТ и ГТ.
• Это отличие зависит не от особенностей характерного диапазона радиочастотного излучения, а от специфических особенностей технологии МЭГТ.
• Принципиальным отличием МЭГТ от ЕГТ и ГТ является мембранотропность эффекта, отсутствующая или минимальная при других методах ГТ. 
• Клеточным маркером МЭГТ является значительная активация апоптоза, внеклеточная экспрессия внутриклеточных белков клеточного стресса и восстановление межклеточных соединений. 
• МЭГТ активирует разнообразные пути клеточного повреждения (кальций-зависимые, каспазозависимые, перекисные), не используемые или ограниченно используемые при ЕГТ и ГТ.

Публикации

1. Yang KL, Huang CC, Chi MS, Chiang HC, Wang YS, Hsia CC, Andocs G, Wang HE, Chi KH. In vitro comparison of conventional hyperthermia and modulated electro-hyperthermia. Oncotarget. 2016 Aug 20. doi: 10.18632/oncotarget.11444. (Электронная допечатная публикация)
2. Wang YS. Different cytotoxic effect from different hyperthermia devices. Comparison of the oncotherm-labehy and the thermotron RF-8 in an in vitro model. 6th Asian Congress on Hyperthermic Oncology,  Fukui, Japan, 5-6 September 2014.
3. Wang YS. Oncothermia heating really induces apoptosis in malignant cells: in vitro comparison with traditional hyperthermia. 1^st Japanese Oncothermia Research Meeting (JORM), Toyama University, Toyama, Japan, October 21, 2015.